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细胞核-胞浆蛋白-胞膜制备试剂盒
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细胞核-胞浆蛋白-胞膜制备试剂盒

 详情说明

​细胞核-胞浆蛋白-胞膜制备试剂盒

货号:ZK-PL3516

规格:50次100次

描述:本试剂盒能够从哺乳动物新鲜或冻存的组织块、贴壁或悬浮细胞中制备细胞核、细胞膜与胞内质膜、细胞浆等三种主要亚细胞组分。其独特的试剂成分与优化的制备方案使胞核-胞浆-胞膜制备过程简单易行,无需特殊设备和超速离心,可在1小时内完成。应用本试剂盒制备的胞膜是细胞膜和细胞器膜如线粒体、内质网及质膜的混合物,得到的细胞核是完整的未裂解细胞核,胞浆组分为可溶性胞浆蛋白。制备得到的产物纯度可胜任后续的免疫沉淀、蛋白印迹、2-D gel、酶活性检测和受体分析等实验。


组成:(以下是50次规格用量)

CER (Cytosol Extraction Reagent)     25ml

MER (Membran Extraction Reagent)     2.5ml

             NER (NuclearExtractionReagent)       50ml Suspension Buffer 10m


储存:各组分4℃有效期12个月


规格:50次  100次


操作步骤:

一.样本预处理:

收集细胞:(在每一次制备过程中,使用等量的细胞数将明显提高后续检测结果的一致性,因此建议在制备前对细胞准确计数)

1. 贴壁细胞:用PBS缓冲液冲洗细胞平皿,用胰蛋白酶消化细胞。800g离心5-10分钟,弃上清,用PBS缓冲液重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。

2. 悬浮细胞:800g离心5-10分钟,弃上清。用PBS缓冲液重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。

以下制备过程要在4oC或冰水浴中进行


二.组织细胞匀浆裂解

1.细胞匀浆裂解:

向每1x107个细胞或每100µl(细胞离心后的体积)细胞沉淀中加入500µlCER试剂,震荡重悬,冰浴2分钟。将细胞悬液转移到冰预冷的玻璃匀浆器内,在冰水浴中上下手动匀浆20-30次。

注意:此破碎细胞步骤为关键环节。要使用1-3ml小容积玻璃匀浆器,须选用间隙严密的研杵,其特征是将研杵插入匀浆器套管后,可提起研杵而套管不会脱落。有效研磨是上下推拉而不是旋转。破碎效果与细胞类型有关,可在相差显微镜下检查,未裂解细胞应小于5%。

2.组织块匀浆裂解:

取250mg哺乳动物新鲜或-80oC冻存组织块放入冰预冷的玻璃匀浆器内,加入500µlCER试剂。用研杵捣碎组织块,上下手动匀浆20次,冰浴10分钟,然后上下手动匀浆7次。

注意:与培养细胞特别是贴壁细胞相比,组织块中的细胞在匀浆时较易破碎,因而并非必须选择间隙严密的研杵。如果研杵与套管过于严密,会使组织匀浆困难,可选用研杵与套管稍松的匀浆器,破碎效果与组织细胞类型有关,可在相差显微镜下检查,未裂解细胞应少于5%。


三.粗提物制备:

取约500µl裂解物,转移到新的离心管中,800g ,4oC离心5分钟。此时,细胞核的粗制品沉淀在管底,上清为胞膜-胞浆混合物。


四.胞膜胞浆制备:

1)将步骤三获得的上清转移到新的离心管中,估计上清的体积;

2)加入上清液1/10体积的MER与上清液混合,冰浴5分钟;

3)14,000rpm,4oC离心30分钟;

4)取上清液转移到新离心管中,此为胞浆组分;

5)沉淀为胞膜组分,含有细胞膜和亚细胞器碎片,可短暂离心除尽液体,用50-100µl Suspension Buffer 或自备溶液重悬胞膜。


五.细胞核制备:

1)向步骤三中获得的细胞核粗提物中加入500µl NER,震荡重悬;

2)4,000g,4oC离心5分钟,弃上清;

3)再次加入500µl NER洗涤细胞核沉淀,重复上述离心步骤,离心后的上清应为清亮; 

4)弃上清,除尽液体。用50-100µlSuspension Buffer重悬细胞核,得到完整和没有破碎的细胞核。用户也可以使用自备溶液如SDS上样缓冲液直接裂解细胞核。


说明:

1.Suspension Buffer 不含去垢剂,重悬于Suspension Buffer 中的胞膜或胞核组分呈不溶解状态是正常的,用户可用自备溶液重悬胞膜或胞核成分。如果进行蛋白印迹、2-Dget等实验,用户可用SDS上样缓冲直接裂解细胞膜或细胞核成分。对于进行免疫共沉淀实验来说,可用RIPA裂解液重悬胞膜或胞核组分。

2.胞浆组分可直接进行蛋白定量。纯的胞膜和胞核蛋白浓度很低,但与胞浆蛋白浓度成比例,因而不需要单独定量,如需定量可加入TritonX-100至终浓度1%或SDS至终浓度0.5%用BCA法蛋白定量。

3.用SDS-PAGE Loading 缓冲液裂解细胞核后,DNA释放会使核裂解物十分粘稠,可95oC加热5分钟,高速震荡打断DNA,重复加热2-3次。

4.如果进行凝胶阻滞(EMSA)实验,建议使用普利莱P1200产品,该试剂盒可直接提取可溶性核蛋白.

5.试剂盒各组分中未添加蛋白酶抑制剂,用户可自行选择添加,通常4oC快速操作不加蛋白酶抑制剂不会出现问题。

6.沉淀胞浆蛋白方法:估算胞浆蛋白组分的体积,加入1/3体积30%三氯醋酸水溶液,-20oC沉淀1小时或过夜。5,000g,4oC离心10分钟,弃上清,空气略干沉淀。用1xSDS上样缓冲液溶解沉淀,95oC加热5分钟,上样电泳。


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