深圳9游总区生物报道：2018年12月31日和2019年1月10日，施一公教授领导的研究团队花开两朵，分别于《自然》（Nature）和《科学》（Science）报道了《人源γ-分泌酶识别底物Notch的结构机制》（Structural basis of Notch recognition by human γ-secretase）以及《人源γ-分泌酶底物淀粉样前体蛋白的识别》（Recognition of amyloid precursor protein by human γ-secretase）的文章，分别报道了分辨率为2.7埃的人体γ-分泌酶结合底物Notch以及分辨率为2.6埃的γ-分泌酶结合淀粉样前体蛋白（APP）的冷冻电镜结构。文章报道了结合两种不同底物后γ-分泌酶发生的构象变化，并对这些构象变化的功能进行了生化研究。上述两篇报道为理解γ-分泌酶特异性识别并切割底物的分子机制提供了重要基础，并为研究与癌症以及阿尔兹海默症相关的药物提供了重要的结构信息。

阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease, AD）是当今世界面临的最为严峻的神经退行性疾病。临床表现为脑组织切片中出现淀粉样斑块，神经元死亡，认知和记忆能力受损，最后脑功能严重受损直至死亡。统计结果表明，在65岁以上人群中，其发病率高达10%，在85岁以上人群中，发病率更是达到30-50%；我国目前患该病的人口高达500万，约占世界患者总数的四分之一，并且由于世界范围内预防治疗手段不足，缺乏特效药物，该疾病有发病年龄提前，发病人数增加的趋势，给病人及家属造成极大痛苦，也同时为社会带来沉重负担。

阿尔兹海默症的发病机理尚不明确。病人脑组织中的淀粉样斑块由淀粉样蛋白前体蛋白（APP, amyloid precursor protein）被酶切割产生的短肽聚集而来。在此切割过程中，最关键的蛋白酶是γ-分泌酶（γ-secretase）。γ-分泌酶由四个跨膜蛋白亚基组成，分别为Presenilin（PS1）、Pen-2、Aph-1和Nicastrin。其中，编码PS1蛋白的基因中有200多个突变与AD病人相关，而PS1正是行使酶切功能的关键活性亚基。这些突变有可能导致PS1功能异常而引起阿尔兹海默症的发生。γ-分泌酶在阿尔兹海默症的发病中扮演着重要角色，很多药物的研发直接以γ-分泌酶作为靶点，希望通过调节其活性来治疗疾病。此外，除淀粉样蛋白外，重要的信号蛋白Notch也是γ-分泌酶的底物。Notch的异常切割会导致发育的异常，与一些诸如T细胞急性淋巴细胞白血病在内的癌症发病也有重要联系。作为与阿尔兹海默症和癌症均紧密相关的蛋白，γ-分泌酶结构的解析与功能的研究一直是重要的科学问题。

施一公教授2006年在清华大学建设实验室之初，就将揭示阿尔兹海默症的发病机理作为重点研究方向，其中一个主要环节是解析γ-分泌酶的高分辨率结构，揭示Presenilin突变体的致病机理。他们经过长期不懈的努力，积累了大量经验教训，先后于近几年取得一系列重要突破（相关论文请见文末）。此次两篇文章报道的研究成果是此前施一公研究组对γ-分泌酶结构与功能系统研究不断深入的延续。如前文所述，尽管施一公研究组已经解析了γ-分泌酶的高分辨率结构，但其如何与底物结合尚不清楚。近年来，多种旨在减少淀粉样沉淀的γ-分泌酶活性抑制剂的临床实验均宣告失败，较为著名的是礼来公司临床实验的Semagacestat。这一抑制剂虽然能够减少淀粉样沉淀，但并不能改善患者的认知状况，更严重的是由于同时抑制了γ-分泌酶对Notch的切割，使得患者罹患癌症的风险大幅增加，最终该临床实验提前终止。究其原因，对γ-分泌酶结合底物机制研究的缺失是造成这一失败的原因之一。基于此，获得γ-分泌酶与底物Notch以及APP复合物的结构，对研究γ-分泌酶的底物识别酶切机理，和以γ-分泌酶为靶标的特异性药物设计具有极大科学意义和潜在应用价值。

由于酶与底物的结合-酶切-解离的过程是高度动态的过程，获得酶与底物的复合物结构难度非常大，而γ-分泌酶与其底物都是跨膜蛋白，获得它们的稳定复合物是世界级难题。施一公课题组通过严谨的设计和筛选，通过半胱氨酸交联的办法，首先成功获得了γ-分泌酶与底物Notch的稳定复合物。通过收集冷冻电镜的数据，他们解析了γ-分泌酶与底物Notch的复合物结构，分辨率高达2.7？，是第一个γ-分泌酶与底物复合物的高分辨率结构，也是第一个膜内蛋白水解酶与底物的复合物结构。之后他们基于不同底物蛋白质序列及结构比对，利用相似的策略，顺利获得了γ-分泌酶与另一个重要底物底物APP的稳定复合物，并获得了其冷冻电镜结构。

γ-分泌酶与底物复合物的结构中，催化亚基PS1发生了较大的构象变化。尤为值得一提的是，在跨膜区靠近细胞内的一侧，PS1通过构象变化，与底物的胞内段形成稳定的β-sheet结构，为稳定底物提供了保证。在此状态下，底物的跨膜螺旋发生解旋，暴露出被酶切的位点。这一结构观察第一次直观证明了长久以来膜内蛋白水解酶酶切底物时，底物蛋白需要发生解旋的猜想。随后科研人员通过生物化学的手段，验证了观察到的构象变化在酶切底物中的作用。根据得到的结构，研究组提出了γ-分泌酶结合底物并依次进行多步酶切的机理：底物的跨膜螺旋随着切割的进行逐步解旋，并与γ-分泌酶形成新的中间态复合物再次进行切割。此外，文章还讨论了底物进入γ-分泌酶活性中心的路径。在后续解析的γ-分泌酶与底物APP穿膜区的复合物结构中，研究者同样发现了前文中描述的特征结构：β-sheet和底物在酶切处的解旋。对于潜在的药物研发来说，研发可以特异地抑制APP的切割而不影响Notch切割的药物，对于治疗阿尔兹海默症且不导致癌症等副作用具有重大价值。对于某些类的癌症的药物研发亦是如此。研究组通过系统性地在结构当中比较Notch与APP穿膜区片段的表面特征揭示了研发这种特异性抑制剂的潜在的结合位点。有很多与阿尔兹海默症相关的突变集中在γ-分泌酶的活性亚基PS1和底物APP上，其中有一些位点是同一位点突变为多个氨基酸的，该研究中通过对结构的详细分析，发现这些对应的反复突变大多集中于γ-分泌酶与APP相互作用界面上，文章还据此分类讨论了这些突变可能影响底物结合的机理。

清华大学生命学院、结构生物学高精尖创新中心施一公教授是两篇研究论文的通讯作者。生命学院博士后、结构生物学高精尖创新中心卓越学者杨光辉、周瑞为两篇论文的共同第一作者。原清华大学生命学院副研究员周强博士，清华大学生命学院一年级博士生郭雪飞参与了这两项研究，清华大学冷冻电镜平台的雷建林博士对数据收集进行了指导。清华大学生命学院博士后、结构生物学高精尖创新中心卓越学者闫创业以及生命学院柯檬博士参与《自然》杂志相关报道的研究。国家蛋白质科学中心（北京）清华大学冷冻电镜平台和清华大学高性能计算平台分别为该研究的数据收集和数据处理提供了支持，冷冻电镜平台的李晓敏对数据收集提供了帮助。北京市结构生物学高精尖创新中心（清华）、生命科学联合中心（清华大学）、科技部和基金委为该研究提供了经费支持。

图1： γ-分泌酶结合Notch复合物的冷冻电镜结构。a. γ-分泌酶结合Notch复合物的密度图。其中橙色标记的为结合的Notch；b. γ-分泌酶结合Notch复合物结构模型；c. 底物结合与不结合状态下催化亚基PS1的结构比较，灰白色为未结合底物的状态，青色和蓝色为结合底物的状态，蓝色部分为发生变化的主要区域； d. PS1与底物跨膜区靠近细胞膜一侧形成β折叠片，从而稳定结合底物；e-f. 与γ-分泌酶结合后底物Notch发生的构象变化。橙色为结合在γ-分泌酶中的Notch构象，灰白色为未结合的构象。

图2：γ-分泌酶结合APP复合物的冷冻电镜结构。a. γ-分泌酶结合APP复合物结构模型；b. PS1与底物APP所形成的β折叠片结构，其中一个来源于底物，另外两个片层来源于PS1；c. APP与Notch跨膜区结合γ-分泌酶状态下表面特征比较，可以观察到两种底物的具体区别；d. APP与γ-分泌酶催化亚基PS1跨膜区中部分与阿尔兹海默症相关突变分布。

相关论文：

1. X. Li et al., Structure of a presenilin family intramembrane aspartate protease.Nature 493, 56, (2013)

2. P. Lu et al., Three-dimensional structure of human γ-secretase. Nature 512, 166, (2014)

3. T. Xie et al., Crystal structure of the γ-secretase component nicastrin. PNAS 111(37) , (2014)

4. S. Dang et al., Cleavage of amyloid precursor protein by an archaeal presenilin homologue PSH. PNAS 112 (11) , (2015)

5. L. Sun et al., Structural basis of human γ-secretase assembly. PNAS 112 (19) , (2015)

6. X. Bai et al., An atomic structure of human γ-secretase. Nature 525, 212, (2015)

7. L. Sun et al., Analysis of 138 pathogenic mutations in presenilin-1 on the in vitro production of Aβ42 and Aβ40 peptides by γ-secretase. PNAS 114 (4) , (2017)

8. R. Zhou et al., Dominant negative effect of the loss-of-function γ-secretase mutants on the wild-type enzyme through heterooligomerization. PNAS 114 (48) , (2017)