深圳9游总区生物报道:DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，调节着许多生物学过程。研究这种修饰的金标准方法是亚硫酸氢盐测序。为此，多家公司推出了亚硫酸氢盐转化试剂盒。这些试剂盒在转化效率上表现不错，但DNA损失和DNA片段化等问题仍让人苦恼。

针对这些问题，比利时根特大学的研究人员近日评估了12种亚硫酸氢盐试剂盒的表现。他们综合利用凝胶电泳、定量PCR、数字PCR以及新一代测序（NGS）等方法，寻找这些试剂盒之间的差异。评估结果于上周发表在《PLOS One》上。

亚硫酸氢盐处理的方法于1992年最早提出，到现在仍然是分析DNA甲基化的金标准。它的原理大家都清楚，亚硫酸氢盐处理使未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（mC）保持不变，之后可通过测序分析甲基化图谱。尽管广泛使用，但这种方法也有缺点。苛刻的反应条件会造成DNA片段化和降解。

在这项研究中，研究人员评估了市场上12种亚硫酸氢盐试剂盒的表现，重点关注DNA片段化。这些试剂盒包括Zymo Research的EZ Gold和EZ Lightning，QIAGEN的Epitect和Epitect Fast，默克密理博的CpGenome、Epigentek的Bisulflash和Bisulflash Easy等。

研究人员利用光谱测定（Qubit 2.0荧光计）和dPCR来确定DNA产量，利用凝胶电泳、qPCR和dPCR来评估DNA降解，并利用新一代测序来确定转化效率。他们发现这些试剂盒存在明显的差异。

以DNA片段化为例，凝胶电泳分析检测到Epitect和CpGenome试剂盒存在较大片段，说明它们的片段化程度最低。利用qPCR对88 bp至476 bp的片段进行扩增时，发现Epitect和CpGenome试剂盒的Cq值最小。同样地，dPCR通过绝对定量，发现这两款试剂盒中的DNA浓度最高。由此可见，这两款试剂盒造成的DNA片段化最少。

在DNA回收率方面，EZ Gold试剂盒表现最佳，而同一家公司的EZ Lightning试剂盒却排名第六。研究人员认为，既然这两种试剂盒采用了相同的DNA脱璜和DNA纯化，那么影响DNA回收率的可能是转化缓冲液和转化条件。

至于哪个试剂盒是最佳的亚硫酸氢盐转化试剂盒，研究人员认为这要取决于具体实验。对于DNA长片段的甲基化研究，Epitect试剂盒是理想之选，因为它造成的片段化最少。在分析短片段时，则要考虑其他因素：如果DNA数量有限，需要高回收率，则EZ Gold似乎是更好的选择。

原文检索

Kint S, De Spiegelaere W, De Kesel J, Vandekerckhove L, Van Criekinge W (2018) Evaluation of bisulfite kits for DNA methylation profiling in terms of DNA fragmentation and DNA recovery using digital PCR. PLoS ONE 13(6): e0199091.